导读：这篇2025年bioRxiv预印本是中美乌合作的结构药物研发论文：用6500万分子超大对接发现TAAR1激动剂，经冷冻电镜验证，最终得到强效、无僵直副作用的精神分裂症候选药，由UCSF、上海药物所、Enamine、杜克大学四家单位主导完成。

1、摘要

精神分裂症是一种严重的精神疾病，当前治疗药物主要靶向多巴胺受体和5-羟色胺受体。这类药物常引发副作用，且在不同患者中的疗效差异显著。痕量胺相关受体1（TAAR1）可调控单胺能信号传导，已成为极具潜力的替代药物靶点。为发现新型TAAR1配体，我们针对TAAR1激活态构象对6500万个小分子进行计算机虚拟对接，并实验验证了55个排名靠前的化合物。结果筛选出14个具有TAAR1激动活性的分子，其效价介于中纳摩尔级至微摩尔级，且均为激动剂。这种高度的功能选择性，可能源于激活态TAAR1正构位点呈现的紧凑构象。尽管该构象利于优先筛选激动剂，但模拟研究表明，若过度优化初始筛选命中率，可能会牺牲后续的亲和力优化空间。本研究通过先导化合物优化，获得了纳摩尔级效力的激动剂，其对接预测的结合模式经冷冻电镜实验验证。其中3个激动剂具有优异的脑暴露量，效力显著优于在研药物乌洛塔罗特，足以开展行为学研究。这3个化合物均能有效逆转小鼠中安非他明诱导的前脉冲抑制缺失（精神分裂症模型），且不会引发传统抗精神病药常见的僵直副作用。

2、引言

痕量胺相关受体1（TAAR1）是一种G蛋白偶联受体（GPCR），近年来因其在调控单胺能神经传递中的作用而备受关注¹。TAAR1可被β-苯乙胺(β-PEA)、酪胺、色胺等痕量胺类，以及安非他明、甲基苯丙胺(METH)等多种合成精神兴奋剂激活²⁻³，其内源性神经递质尚未明确。与主要表达于嗅觉区域的其他TAAR家族成员不同⁴，TAAR1广泛分布于大脑，尤其在腹侧被盖区（VTA）、中缝背核（DRN）等单胺能核团中高表达⁵⁻⁶。这种分布与其对多巴胺能⁵和5-羟色胺能⁷系统（包括奖赏回路与情绪调控）的调节作用高度吻合⁸。这些特性使TAAR1成为精神分裂症、焦虑、抑郁、精神兴奋剂成瘾等精神疾病的潜在治疗靶点⁶,⁹⁻¹¹。事实上，兼具强效TAAR1激动活性与5-HT₁A受体活性的药物SEP-363856（乌洛塔罗特），已被开发为精神分裂症新型治疗药物¹¹⁻¹²。乌洛塔罗特旨在同时改善精神分裂症的阳性与阴性症状，同时降低传统抗精神病药常见的副作用¹³⁻¹⁴。尽管早期研究结果喜人，但该药物在Ⅲ期临床试验中未达到主要终点，研发进程终止。

尽管乌洛塔罗特研发受挫，TAAR1仍是治疗精神分裂症的重要靶点¹⁵⁻¹⁹，目前正通过基于受体同源模型的大规模分子对接筛选，探索全新化学骨架的配体¹⁷,²⁰。近期，大规模分子对接技术在多个药物靶点上展现出巨大潜力⁹,²¹⁻³⁴。本研究利用最新解析的TAAR1激活态实验结构，开展新型激动剂的发现工作。通过大规模分子对接，我们获得了效力介于23nM至20μM的TAAR1激动剂，总体筛选命中率（活性化合物数/测试化合物数）达25%（14/55）。我们对其中3个激动剂进行活性与药代动力学优化，最终获得TAAR1效力为1~48nM的优化产物。令人振奋的是，这些化合物同时对5-HT₁A受体具有活性——该受体与TAAR1协同作用可实现抗精神病疗效³⁵⁻³⁶。尽管其对5-HT₁A受体的效力相对较低（260~600nM），但显著优于乌洛塔罗特，且结合分子在脑中达到的微摩尔级游离浓度，该活性具有重要临床意义。凭借高效力与良好的药代动力学特性，我们进一步在小鼠模型中评估了这3个化合物的抗精神病样药效。

3、结果

大规模分子对接筛选发现TAAR1激动剂

本研究以TAAR1正构结合口袋为对接靶点，该口袋的构象主要参照激动剂RO5256390在该位点的结合模式（PDB：8W8A）（图1a、b）。采用DOCK3.7软件²¹,³⁸，以预设的热点（“匹配球”）为导向进行分子取向采样。针对每个取向，基于预计算的低能构象系综，最多采样200个配体构象³⁸⁻³⁹。通过泊松-玻尔兹曼法QNIFFT计算的预生成静电势网格，评估配体构型的静电互补性⁴⁰；利用AMBER力场的预生成范德华项，评估非极性互补性⁴¹。同时采用SOLVMAP计算配体的环境依赖性去溶剂化能⁴²。

与纯实验研究类似，在开展前瞻性对接筛选前，对照计算是重要的合理性验证手段⁴³。我们通过测试能否在大量性质匹配³⁸与极值诱饵分子⁴³⁻⁴⁵中，将已知TAAR1激动剂排名靠前，验证采样方法与能量势图的可靠性。通过调整静电计算中低介电与高介电区域的边界，优化静电能与去溶剂化能参数，最终实现对数加权AUC值达31.7（扩展数据图1b）。该优异结果表明，我们的方法能有效区分TAAR1真配体与诱饵分子。

完成对照验证后，我们从ZINC22化合物库⁴⁶中筛选约6500万个类片段阳离子分子（非氢原子数11~19个）进行对接。该计算耗时39993核小时，在1000核集群上运行不到两天即可完成。为获取全新结构化合物，我们从得分前382767的分子中，剔除拓扑结构与已知TAAR1激动剂相似的化合物（ECFP4指纹塔尼莫托系数>0.35的分子均被移除）。为确保配体阳离子与受体正构结合口袋内的D103³・³²、Y294⁷・⁴³、F267⁶・⁵¹、F268⁶・⁵²、I104³・³³、F186ECL2等识别位点直接相互作用，我们采用LUNA软件进行基于相互作用指纹的过滤。该步骤确保阳离子不仅能与D103³・³²区域的受体静电势良好互补（DOCK3.8的打分依据），还能形成可识别的离子对。剩余95126个化合物按拓扑结构聚类（见方法），并通过Chimera软件⁴⁷对排名靠前簇中的最优得分分子进行可视化评估。从中挑选2462个结构多样的化合物（任意两个分子ECFP4塔尼莫托系数≤0.25），评估其结合几何构型与相互作用合理性，最终优先选定66个化合物，其中55个由Enamine公司成功合成，合成满足率达83%（图1b）。

为评估化合物对TAAR1的激活能力，我们首先采用活细胞GloSensor功能实验⁴⁸，在10μM浓度下对55个对接命中化合物进行初筛，检测其通过招募Gs蛋白诱导cAMP产生从而激活TAAR1的能力（图1a）。结果显示，55个化合物中有14个表现出激动活性，其最大效应（Emax）超过乌洛塔罗特（SEP-363856）的30%（图1c、扩展数据图1a、表1）。浓度响应实验证实，这些化合物均为TAAR1激动剂，其半最大效应浓度负对数值（pEC₅₀）为4.7~7.6，最大效应（Emax）为乌洛塔罗特的44%~108%（图1c、扩展数据图1c）。基于效力与新颖性（ECFP4塔尼莫托系数分别为0.27、0.18、0.20），我们优先选择Z1197877490、Z1255361401、Z8700802749三个化合物进行基于结构的优化（图1c~e、扩展数据图2~3、表1~2）。

仅筛选到激动剂

理论上，针对受体激活态或失活态进行对接，应分别倾向于发现激动剂或拮抗剂。尽管我们在部分靶点上观察到该规律²⁵,⁴⁹⁻⁵¹，但多数情况下会同时筛选到激动剂与拮抗剂²¹,²⁸,⁵²⁻⁵⁴。这一结果符合普遍认知：对接主要筛选结合能力，难以区分配体的激活/抑制功能。然而，本研究针对TAAR1激活态对接获得的14个活性化合物均为激动剂，55个测试化合物中无拮抗剂活性分子（补充图1）。为探究该现象，我们对比了28个激动剂（14个新激动剂+14个已知激动剂）与7个已知拮抗剂⁷,⁵⁶⁻⁵⁷，分别对接至TAAR1实验激活态结构与Boltz-2构建的失活态模型⁵⁵时的得分与排名。在TAAR1激活态结构中，28个激动剂中有23个排名进入对接库前0.5%，DOCK得分为-54~-33kcal/mol；而7个拮抗剂中仅1个进入该范围，得分为-45kcal/mol。对接至失活态模型时，激动剂得分变差（负值减小），为-44~-26kcal/mol，平均降低8.5kcal/mol，排名大幅下降；拮抗剂表现则显著提升，最优拮抗剂得分达-46kcal/mol，另有两个拮抗剂得分-42~-35kcal/mol，进入排名前列（扩展数据图4）。

TAAR1激活态对接能优先筛选激动剂、失活态结构相对优先筛选拮抗剂的独特能力，可能源于激动剂与拮抗剂的尺寸差异，以及受体激活/失活态的构象体积差异。TAAR1激动剂通常小于拮抗剂，且受体激活时正构位点会收缩（对接所用的TAAR1模型结构中，该位点收缩更为显著，下文将详述）。α2A肾上腺素受体也存在类似现象：针对其激活态对接同样仅筛选到激动剂²⁵。这表明，当受体激活态与失活态的物理性质（如结合口袋体积）差异显著时，对接预测配体功能（激动剂/拮抗剂）的能力最强；若差异较细微，对接则难以区分配体功能类型。

初始命中化合物优化

为提升初始对接活性化合物的效力，我们采用两种优化策略：一是通过Enamine REAL数据库（如SmallWorld程序，https://sw.docking.org/）搜索结构类似物；二是在合成可行的前提下，对初始命中化合物进行保守修饰，该策略往往效果显著⁴²。

我们从SmallWorld数据库中为Z1197877490筛选2012个类似物，并设计27个衍生小分子；为Z1255361401筛选1707个类似物，设计13个衍生小分子；为Z8700802749筛选873个结构类似物。将所有类似物对接至TAAR1，基于结合效果（得分与可视化评估）优先选择少量化合物进行合成，最终Enamine成功合成5个Z1197877490类似物、6个Z1255361401类似物、1个Z8700802749类似物。母体激动剂Z1197877490的TAAR1 EC₅₀为23nM，将其氧原子替换为碳原子或硫原子等修饰仅小幅提升效力（图2a）；立体化学纯化得到EN300-47307925（图2a、扩展数据图2a），对TAAR1效力影响甚微，但使5-HT₁A EC₅₀提升26倍至261nM，接近乌洛塔罗特的10 倍。相反，对EC₅₀为269 nM的Z1255361401进行小幅修饰，可显著提升效力（图2b、扩展数据图2b）：将吡啶环内氮原子移位或替换为苯环，活性提升59~107倍；手性拆分获得Z898713207（EC₅₀ 3nM）与Z1255382255（EC₅₀ 1nM），后者对5-HT₁A的EC₅₀为380nM（图2b、扩展数据图2b）。最后，Z8700802749系列需进行较大修饰才能提升效力：将阳离子氮原子向远离苯环的方向移动两个碳原子，活性提升37倍（图2c、扩展数据图3a）；手性拆分获得Z8987197482，其TAAR1 EC₅₀为48nM，5-HT₁A EC₅₀为604nM（图2c、扩展数据图3a）。对接构象显示，Z8987197482的连接链缩短一个碳原子，使四氢化萘基团更靠近结合口袋中心，可能增强π-π堆积作用（扩展数据图2c）。

冷冻电镜结构解析

为阐明配体识别的分子机制并为后续优化提供模板，我们解析了TAAR1与两个低纳摩尔级激动剂Z1255382255、Z8987197482的复合物结构（图3a~b、扩展数据图5~6、补充数据表1）。两个复合物的冷冻电镜密度图全局标称分辨率分别为3.14Å与3.12Å。复合物整体结构与已报道的TAAR1实验结构相似，与PDB 8W8A结构的均方根偏差（RMSD）分别为0.492Å与0.846ų⁷。

在这两个TAAR1结构中，受体均呈现典型的激活构象，两个激动剂均结合于正构位点，TM6螺旋向外偏移程度相近。TAAR1主要通过两个配体片段识别激动剂：一是芳基片段，与F268⁶・⁵²、F186^(ECL2)、I104³・³³形成的亚口袋发生π-π堆积与疏水相互作用；二是阳离子胺基，与D103³・³² 形成离子对。这些相互作用既被对接预测，也被冷冻电镜结构证实。Z1255382255与Z8987197482的对接预测构象与实验观测构象的RMSD分别为2.3Å与1.4Å（图3a~b）。

尽管实验构象与预测构象形成的受体相互作用一致，但两者结构存在显著差异。Z1255382255的实验构象相较于对接预测的伸展平面构象发生构象旋转，使苯环呈倾斜角度，既与F268⁶・⁵²形成π-π相互作用，又更靠近ECL2环上的F186；同时，饱和环系统内的阳离子氮原子发生位移，优化与D103³・³²的盐桥形成，阳离子氮原子靠近D103³・³²时，该残基略微向外偏移。类似地，Z8987197482向ECL2环偏移，苯环更靠近F268⁶・⁵²，其阳离子氮原子也更靠近D103³・³²，导致该残基的侧向位移大于Z1255382255结合结构（图3a~b）。总体而言，这两个化合物的实验与对接结构共同解释了其构效关系（SAR）。例如，从3nM的吡啶衍生物Z898713207变为1nM的苯环衍生物Z1255382255，与苯环在TAAR1非极性“芳基笼”中的定位一致：吡啶环在该位点需付出去溶剂化代价且无极性相互作用补偿，而苯环则无此代价。同理，Z8700802749（12μM）的吗啉环替换为Z8987197482（48nM）的环己基（两者均结合于非极性亚口袋），后者平面性降低、结合更契合，解释了其效力提升超250倍的原因。

与基于AlphaFold2 TAAR1模型的对接对比

近期一项有趣研究中，研究者采用分子对接技术，针对AlphaFold2（AF2）预测的TAAR1模型发现新型激动剂²⁰。该研究从100个模型中，筛选出能最优富集已知TAAR1配体的模型用于前瞻性大规模库筛选，该策略为该团队首创⁵⁸。实验验证高排名分子后，预测命中率达60%，最优化合物EC₅₀为35nM。从命中率来看，该结果显著优于本研究采用相同对接程序获得的结果，而两者亲和力相近。尽管AF2模型为失活态构象（图4a），但其筛选的所有新配体均为功能性激动剂。如何解释这些现象？

通常认为，实验解析的全激活态结构（如本研究的冷冻电镜结构）应至少与AF2模型效果相当，且更易偏向筛选激动剂。AF2方法的优势之一是计算多个模型，并选择对照实验中配体富集效果最优的模型用于前瞻性筛选，这可能是其前瞻性高命中率的关键，但也可能带来意外后果。AF2模型成功的原因之一，是其正构位点异常紧凑，多个残基向配体口袋收紧，相较于实验结构（图4b），结合口袋体积为513~639ų（因模型而异），远小于本研究实验结构的746ų。这使对接偏向筛选TAAR1偏好的小分子阳离子激动剂，但AF2正构位点过度收缩，导致本研究发现的多种配体无法进入该口袋（图4c）。同时，过度紧凑的口袋也限制了初始分子的效力优化空间，导致AF2对接筛选的最优激动剂优化后效力与初始命中化合物相近。而本研究冷冻电镜结构的更大正构位点，使我们能将化合物优化至1nM水平，最终贡献了其优异的体内效力（见下文）。这表明，通过配体富集选择模型结构的策略（该领域广泛应用，包括本团队研究⁵⁹⁻⁶¹），虽能优化初始发现效率，但可能给后续优化带来挑战。

新型TAAR1激动剂的体内抗精神病样活性

为评估化合物Z8987163207、Z1255382255、Z8987197482的治疗潜力，我们首先测定其在小鼠腹腔注射（10mg/kg）后的药代动力学特征（扩展数据图7、补充数据表2）。三个化合物均具有优异的脑与脑脊液（CSF）暴露量，脑脊液浓度常作为脑内游离浓度（Fu）的通用替代指标。其中Z8987163207的脑脊液峰浓度（Cmax）达3040ng/mL（约18μM），约为Z1255382255与Z8987197482的两倍；脑脊液药时曲线下面积（AUC）为292000ng・min/mL，而Z1255382255与Z8987197482分别为67400与123000ng・min/mL；脑脊液半衰期（T₁/₂）为56分钟，Z1255382255与Z8987197482分别为35与64分钟。综上，Z8987163207、Z1255382255、Z8987197482兼具TAAR1高效力与高脑暴露量，受体覆盖率（游离浓度/EC₅₀）达1000~10000倍。因此，我们通过前脉冲抑制（PPI）行为学实验评估其抗精神病样药效，该实验是公认的TAAR1激动剂药效评价模型¹²,⁶²⁻⁶³。

听觉惊跳反射的前脉冲抑制（PPI）用于评估弱前刺激对后续强惊跳刺激反应的抑制能力。精神分裂症患者存在PPI缺陷⁶⁴，啮齿类动物的类似缺陷被用于模拟精神病样状态⁶⁵。我们通过腹腔注射安非他明（AMPH）诱导小鼠PPI缺陷，该方法是啮齿类PPI破坏模型的经典方案，而抗精神病药物可逆转该缺陷。

小鼠先腹腔注射溶剂（Veh）或新型TAAR1激动剂（图5a~c），10分钟后再注射溶剂或3mg/kg安非他明。实验分组包括：溶剂-溶剂对照组、化合物-溶剂对照组、溶剂-安非他明阳性对照组、化合物-安非他明实验组（统计数据见补充表3，图中显示事后检验值）。Z8987163207实验结果显示，溶剂-安非他明组的PPI相较于溶剂-溶剂对照组与0.5mg/kg Z8987163207-溶剂组显著降低（图5a），而0.5mg/kg Z8987163207可逆转安非他明诱导的PPI 损伤。类似地，Z1255382255实验中，溶剂-安非他明组的PPI相较于溶剂-溶剂对照组、0.2mg/kg Z1255382255-溶剂组、0.2mg/kg Z1255382255-安非他明组显著降低（图5b）；0.1mg/kg Z1255382255-安非他明组的PPI相较于溶剂-溶剂对照组与0.2mg/kg Z1255382255-安非他明组降低，表明0.2mg/kg剂量的Z1255382255能更有效逆转安非他明诱导的PPI损伤。最后，Z8987197482实验显示，溶剂-安非他明组的PPI相较于溶剂-溶剂对照组与0.2mg/kg Z8987197482-安非他明组显著受损（p≤0.050），表明0.2mg/kg Z8987197482可有效修复PPI缺陷（图5c）。综上，Z8987163207、Z1255382255、Z8987197482均可逆转溶剂-安非他明诱导的PPI破坏，其中Z1255382255与Z8987197482效果更优，可能与其靶点效力更高相关。三个化合物均能强效改善安非他明小鼠模型的PPI缺陷。

除PPI外，我们还评估了三个激动剂对空白反应、惊跳反应与僵直行为的影响。溶剂-溶剂组与化合物-溶剂组的空白反应持续处于低水平，显著低于溶剂-安非他明组与至少一个化合物-安非他明组（补充图2a~c）。三个化合物对脉冲/惊跳反应的影响略有差异，但总体而言，各化合物最高剂量组的脉冲反应低于其他组（补充图2d~f）。我们还评估了化合物诱发僵直的潜力，这是当前多数抗精神病药的严重不良反应。在能逆转安非他明诱导PPI破坏的剂量下，Z1255382255（0.2mg/kg，腹腔注射）、Z8987197482（0.2mg/kg，腹腔注射）、Z8987163207（0.5mg/kg，腹腔注射）处理的小鼠，在60分钟与90分钟均未观察到僵直行为；而经典多巴胺受体拮抗剂氟哌啶醇（1mg/kg，腹腔注射）处理的小鼠则出现明显僵直，且持续至少90分钟（图5d）。这表明，新型激动剂相较于经典抗多巴胺能药物，具有更优的僵直相关安全性。基于小鼠PPI实验的文献数据，新型化合物在低至0.2mg/kg剂量下即展现显著活性，其效力至少与乌洛塔罗特相当，甚至更优。

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结论

本研究有四项核心发现值得重点强调：第一，通过大规模分子对接与结构导向优化，获得了对TAAR1具有纳摩尔级效力、对5-HT₁A具有亚微摩尔级活性的激动剂，其体外与小鼠体内效力均优于乌洛塔罗特。第二，筛选仅获得激动剂，这可能源于对接采用TAAR1激活态结构——其正构位点收缩包裹激动剂，优先选择小分子激动剂样化合物，排斥大分子拮抗剂样化合物。该观点与此前基于AlphaFold2 TAAR1模型的对接研究一致²⁰：尽管AF2模型整体为失活态，但其正构位点收缩更显著，激动剂命中率更高。AF2模型过度紧凑的正构位点虽提升命中率，但可能限制后续强效先导化合物优化，这可能是优化对接参数时过度适配AF2模型结构所致。第三，本研究的对接预测结果基本被后续冷冻电镜结构验证，为化合物进一步优化提供模板。第四，三个新型激动剂能强效逆转安非他明诱导的 PPI 破坏，且不引发经典多巴胺受体拮抗剂的关键副作用——僵直。这些新型TAAR1激动剂相较于已上市的典型抗精神病药，可能具有更宽的治疗指数。

本研究存在若干局限性：尽管获得了对TAAR1与5-HT₁A受体效力提升的激动剂，但其主要靶点仍为TAAR1，对5-HT₁A仅具中等效力。新型激动剂虽与已知TAAR1配体拓扑结构不同，但因受体正构位点狭小，共享部分物理特征与部分核心骨架。最后，仅通过安非他明诱导的急性精神病PPI模型评估了Z8987163207、Z1255382255、Z8987197482的体内活性，其对其他行为表型的影响及潜在不良反应尚未探究。

这些局限性并未掩盖本研究的核心成果：针对TAAR1的大规模分子对接结合结构优化，发现了一系列与已知配体拓扑结构无关的低纳摩尔级TAAR1激动剂。靶向受体激活态成功偏向筛选激动剂，冷冻电镜结构基本验证了对接预测。新型TAAR1激动剂的优异物理性质（库选择与对接命中时严格把控）使其具备高中枢神经系统暴露量，行为学改变既改善感觉运动门控，又降低僵直副作用。这些化合物的结构与药理学特性区别于已知TAAR1在研药物，支持其进一步优化，同时也验证了基于结构的配体发现策略在该重要受体研究中的价值¹⁷,²⁰。

文中全新化合物及其二维结构列表见补充表1~2，所有化合物可从Enamine订购。