Nature  ·  2026年5月21日  ·  华盛顿大学David Baker团队及合作者

结合GPCR，并不必然意味着能够按预期调控GPCR。一个候选分子是激动剂、拮抗剂，还是只结合而不产生目标效应，需要功能实验判断。这也是面向GPCR设计蛋白质配体时必须解决的问题。

David Baker团队及合作者在Nature发表的研究，将计算设计与高通量筛选结合，获得了针对多个GPCR的微型蛋白激动剂和拮抗剂。五种微型蛋白与受体复合物的冷冻电镜结构支持其设计结合模式，其中一种CXCR4拮抗剂还在小鼠中实现了造血干细胞和祖细胞动员。[1]

微型蛋白怎样接近GPCR口袋

GPCR的配体识别区域既可能位于胞外结构域，也可能深入七次跨膜螺旋形成的口袋。对于后者，候选蛋白需要伸入口袋并形成合适的接触，同时适应受体的构象变化。仅获得一个能结合受体表面的蛋白，往往还不够。

研究采用了适配不同靶点的设计路线。其中一条路线先在口袋内放置短肽基序，再利用RFdiffusion围绕该基序生成支架并设计序列，使结合片段能够得到支架支持。另一条路线从预测蛋白结构中寻找具有合适突出片段的支架，经过对接和序列重设计构建结合界面。

微型蛋白可以通过局部突出的结合片段接近口袋，同时利用其余支架稳定折叠并形成额外接触。这种结构安排增加了可调整的结合界面，具体候选物的选择性和组织分布仍需分别测定。

先筛选结合分子再测定药理功能

为减少大规模筛选对纯化受体的依赖，研究者建立了受体分流显微筛选方法。该方法利用细胞内受体的定位变化识别候选结合蛋白：带有内质网滞留信号的候选蛋白若与受体结合，可改变受体沿分泌途径转运的过程，荧光成像则用于读取这一变化。

图1  受体分流筛选流程。通过受体与候选微型蛋白共表达后的定位变化筛选可能的结合分子，再用独立实验检验其结合与药理功能。依据文献[1]所述原理绘制，为方法示意图。

受体分流首先提供结合相关的筛选线索，不能直接区分激动与拮抗。研究者还需要对命中分子开展独立的结合和信号测定。这种筛选保留了细胞内的膜环境，但受体和候选蛋白经过构建与标记，其结果需要与其他实验读出相互参照。

功能结果与结构结果分别说明什么

研究面向11个GPCR开展设计与筛选，获得了包括MRGPRX1、NK1R激动剂以及CXCR4等受体拮抗剂在内的功能性分子。各靶点采用的设计路线及后续验证深度有所不同，研究中对代表性分子进行了较详细的药理和结构分析。

以NK1R为例，设计分子在细胞cAMP测定中表现出浓度依赖性激动作用。曲线同时提供效力与最大响应的信息，能够与天然配体P物质进行比较；它并不直接给出结合亲和力。

图2  设计分子对NK1R的激动作用。dNK1系列分子与P物质的cAMP浓度响应曲线；纵轴以最大响应百分比表示。来源：文献[1]相关图版。

冷冻电镜则检验设计模型能否重现实验中的受体结合状态。研究解析了五种微型蛋白与受体复合物的结构，整体结合模式与计算模型接近。MRGPRX1的结构叠合还显示了不同配体结合状态下的局部差异，便于进一步讨论受体激活所涉及的相互作用。

图3  MRGPRX1在不同配体结合状态下的结构比较。图中叠合了mM1_060、mM1_068和BAM(8–22)对应的受体结构，并标出部分口袋残基。该图用于比较结合口袋构象。来源：文献[1]相关图版。

CXCR4拮抗剂在小鼠中实现细胞动员

CXCR4拮抗剂dCX1_001提供了从结构到动物功能的进一步验证。其受体复合物冷冻电镜结构与设计模型接近，支持设计分子按预期进入CXCR4口袋并建立相互作用。

图4  dCX1_001与CXCR4复合物的实验结构及设计模型比较。彩色结构为冷冻电镜解析结果，灰色为RFdiffusion设计模型；右侧显示口袋局部及部分参与识别的残基。来源：文献[1]相关图版。

动物实验将dCX1_001与已用于临床的CXCR4拮抗剂AMD3100（plerixafor）比较。给药后，两者均可促进造血干细胞和祖细胞进入外周血；在研究采用的实验条件下，dCX1_001的动员水平与AMD3100相当。图5展示了外周血集落形成单位随时间的变化。

图5  dCX1_001与AMD3100给药后外周血集落形成单位的时间变化。该结果反映造血干细胞和祖细胞动员相关的功能读出，评价范围限于图示动物实验条件。来源：文献[1]相关图版。

研究还报告，dCX1_001引起的白细胞增多较AMD3100轻。[1,2] 这一观察可用于讨论动员的选择性及耐受性，尚不足以支持整体安全性优于已有药物的判断。这项动物实验以细胞动员为终点，尚未评价抗肿瘤治疗效果。

后续开发仍取决于功能和成药性评价

设计受体结合蛋白时，静态结构对功能的约束仍有限。研究中，部分面向失活态受体的设计仍出现了激动作用，说明结合位置和受体状态之间的关系不能完全靠一次结构预测确定。后续优化需要结合不同信号通路的读出，判断效力、最大效应及选择性是否符合预期。

对于拟进一步开发的微型蛋白，血清稳定性、体内暴露、给药途径与免疫原性都需要专门评价。短期动物功能结果能够支持候选分子的研究价值，但尚不能代替这些数据。已获得的配体序列、功能曲线和复合物结构，可用于后续序列优化与构效关系分析。

原文与研究资源

[1] Muratspahić E, Feldman D, Kim DE, et al. De novo design of miniproteins targeting GPCRs. Nature, 2026, 656(8129): 1044–1053. 论文链接

[2] Muratspahić E, Feldman D, Kim DE, et al. De novo design of miniprotein agonists and antagonists targeting G protein-coupled receptors. bioRxiv, 2026年5月10日更新的预印本版本。 论文链接